Ilościowa i jakościowa ocena zakażenia kleszczy patogenami, z uwzględnieniem genogatunków Borrelia burgdorferi sensu lato.

Dla Borrelia burgdorferi sensu lato amplifikowany był fragment genu fla, kodujący białko rzęskowe flagellinę. Startery zastosowane do reakcji były komplementarne do wszystkich znanych sekwencji genu fla B. burgdorferi s. l.  Z kolei do identyfikacji gatunkowej Borrelia wykorzystano reakcję PCR/RFLP. Cięcie enzymem restrykcyjnym (Fsp4H1) fragmentu genu fla, umożliwiło  identyfikację genogatunków B. burgdorferi s. l.  Do każdej reakcji PCR oraz PCR/RFLP zastosowana została kontrola pozytywna i negatywna. Detekcja specyficznych produktów amplifikacji oraz reakcji RFLP była dokonana metodą  elektroforezy poliakrylamidowej. Do detekcji B. burgdorferi s.l. wykorzystano specyficzne startery BFL1/BFL2 dla konserwatywnego fragmentu genu kodującego flagelinę. Z kolei, do detekcji Anaplasma phagocytophiulum i pierwotniaków z rodzaju Babesia wykorzystano zestawy diagnostyczne zawierające startery specyficzne dla fragmentu genu 18s rDNA do diagnostyki Babesia sp., oraz  dla fragmentu genu 16s rDNA do wykrywania A. phagocytophilum (Blirt S.A., Polska). DNA z kleszczy izolowano metodą amoniakalną. Koncentrację DNA mierzono spektrofotometrycznie. Produkty amplifikacji rozdzielano na 2% żelu agarozowym barwionym bromkiem etydyny. Do badań molekularnych wybrano około 2870 zamrożonych okazów kleszczy Ixodes ricinus. Ogółem 268 kleszczy zbadano na obecność DNA Babesia sp., 107 kleszczy na obecność DNA Borrelia burgdorferi sensu lato oraz 284 kleszcze na obecność DNA Anaplasma phagocytophilum. Ponadto wybrano i przygotowano 650 kleszczy w celu detekcji genogatunków Borrelia burgdorferi. Kleszcze pochodziły z terenów rekreacyjnych Górnego Śląska (Dziećkowice, Rogoźnik, Korzonek, Borowa Wieś, Przeczyce, Goczałkowice, Kozłowa Góra, Gwoździany, Beskid mały, Racibórz, Żabie Doły, Żywiec, Krupski Młyn, Boruszowice) oraz wybranych stanowisk na terenie województw małopolskiego, świętokrzyskiego i podkarpackiego. Przeprowadzone badania wykazały, że 21,42% badanych kleszczy było zakażonych Borrelia burgdorferi sensu lato, największy poziom zakażenia stwierdzono na terenie Goczałkowic (14,28 % badanych kleszczy). Obecność pierwotniaków z rodzaju Babesia stwierdzono u 5,7 % badanych kleszczy; najwyższy poziom zarażenia tym pierwotniakiem wystąpił na terenie Dziećkowic  gdzie zarażonych było 4,02 % badanych kleszczy. Riketsje Anaplasma phagocytophilum stwierdzono u 29,10 % badanych kleszczy, najwyższy poziom zakażenia tym patogenem wystąpił na terenie Kozłowej Góry (7,8% badanych kleszczy). Popularnym miejscem rekreacyjnym na terenie województwa małopolskiego jest Puszcza Niepołomicka. Jest to duży kompleks leśny usytuowany około 30-40 km na wschód od Krakowa, masowo odwiedzany przez wycieczki szkolne i zbieraczy runa leśnego. Wielkość amplifikowanego fragmentu wynosiła w przypadku A. phagocytophilum 227, w przypadku Babesia sp. 560, a w przypadku B. burgdorferi sensu  lato 442 par zasad. Ogółem z terenu Puszczy Niepołomickiej zebrano 129 okazów kleszczy. Wszystkie zebrane osobniki należały do gatunku Ixodes ricinus. Do analizy molekularnej wybrano losowo 30 kleszczy (po 10 z każdego stanowiska).  Ogólnie A. phagocytophilum stwierdzono u 23 (76,6%), Babesia sp. u 18 (60%), a krętki B. burgdorferi s.l. u 1 (3,3%) kleszcza. Współwystępowanie A. phagocytophilum i Babesia sp. stwierdzono u 17 (56,6%), A. phagocytophilum, Babesia sp. i Borrelia burgdorferi s.l. u 1 (3,3%) kleszcza. Najwyższe narażenie na A. phagocytophilum wykazano w Przyborowie koło szkółki leśnej gdzie 9/10 (90%) wybranych do analizy kleszczy było zakażonych tym patogenem. W przypadku Babesia sp. wysokie ryzyko istnieje w rejonie bagna za Dębem Augustyna gdzie 10/10 (100%) kleszczy było zakażonych tymi pierwotniakami. Natomiast w rejonie Przyborowa koło Drogi Królewskiej nie stwierdzono kleszczy zakażonych Babesia sp. Otrzymane wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że A. phagocytophiulum i Babesia sp. stanowią poważne zagrożenie na terenie Puszczy Niepołomickiej. Dlatego ludzie, przebywający na tym terenie i pracownicy leśni powinni się odpowiednio zabezpieczać, żeby zmniejszyć ryzyko zarażenia patogenami przenoszonymi przez kleszcze. Zbadano także na obecność patogenów 28 kleszczy zdjętych z pacjentów. Procent kleszczy zakażonych B. burgdorferi wynosił 32,14%, podczas gdy procent kleszczy zakażonych Anaplasma phagocytophilum wynosił tylko 3,93%. Żaden z badanych osobników kleszczy nie był zarażony piroplazmami z rodzaju Babesia.